該研究揭示了一種由缺氧特異性誘導的ZHX2相分離機製。研究發現，轉錄因子ZHX2在缺氧反應下發生相分離，促進其在染色質上的占據，並激活一係列癌基因的轉錄。這些基因富集為轉移相關基因
，且不同於HIF的靶點
，與乳腺癌的病理進展密切相關。機製上，缺氧通過一個富含脯氨酸的內在無序區誘導ZHX2相分離
，這會增強ZHX2在S625和S628位點的磷酸化

，進而將CTCF招募到轉錄凝聚體中，改變染色質環，最終驅動轉移基因的轉錄和癌症轉移。這些發現為理解癌基因激活提供了重要見解，並提示了一種基於相分離的癌症治療策略。

1、ZHX2在缺氧反應下形成核內凝聚體

研究通過熒光成像技術
，在多種乳腺癌細胞係（MCF7, T47D, MDA-MB-231）中觀察到
，ZHX2-EGFP在缺氧（1% O₂）條件下會形成明顯的核內凝聚體，而在常氧（21% O₂）條件下則彌散分布。

這種凝聚體的形成是可逆的，在複氧後30秒內斑點即消失。ZHX2的聚集是缺氧特異性的，在其他細胞應激（如pH變化、葡萄糖/穀氨酰胺饑餓、MG132、UV照射等）下均未觀察到斑點形成。

而在乳腺癌患者的腫瘤組織和異種移植腫瘤模型中也觀察到了ZHX2核凝聚體。

2
、富含脯氨酸的IDR介導ZHX2的缺氧誘導相分離

研究使用1,6-己二醇（1,6-hex）處理細胞，可阻斷缺氧誘導的ZHX2凝聚體形成。

體外純化的重組ZHX2-EGFP蛋白在特定濃度下也表現出鹽敏感的球形斑點
，證實了ZHX2凝聚體具有相分離特性。通過結構預測和OptoDroplet光遺傳學技術分析，研究發現ZHX2的核定位序列（NLS；317-446 aa）區域內的IDR是驅動其相分離的主要區域；

刪除NLS（ΔNLS）則無法在光照或缺氧下形成斑點（D-G）。

將該區域的7個脯氨酸全部突變為丙氨酸（PA突變體）後
，ZHX2在缺氧條件下完全喪失了形成凝聚體的能力。這表明，該富含脯氨酸的IDR是ZHX2響應缺氧並誘導相分離的關鍵。

3、ZHX2相分離作為支架招募轉錄激活複合體

免疫熒光染色顯示，缺氧誘導的ZHX2凝聚體與多種轉錄激活標記（H3K27ac, H3K4me1, H3K4me3, MED1, BRD4, RNA Pol II-S5P, p300）高度共定位。

Co-IP實驗證實
，與常氧相比


，ZHX2在缺氧時與RNA Pol II-S5P, p300, BRD4, 和 MED1的相互作用顯著增強。

而無法發生相分離的PA突變體，在缺氧時幾乎不與這些共激活因子共定位，也幾乎不發生相互作用。這些結果表明，ZHX2在缺氧時首先獨立發生相分離，並作為“支架”招募這些轉錄共激活因子到凝聚體中。

4
、ZHX2相分離激活一套不同於HIF靶點的轉移基因特征集

ChIP-seq分析結果顯示，在缺氧條件下，ZHX2在全基因組的占據位點數量和結合強度均顯著增加
，而PA突變體的基因組占據和結合強度與WT型相比則明顯下降
，表明ZHX2的相分離是其在缺氧時廣泛結合染色質所必需的。

結合RNA-seq的結果綜合分析，研究鑒定出125個“ZHX2 相分離基因”，它們在缺氧時以相分離依賴的方式被ZHX2直接結合並轉錄激活
，且其激活獨立於HIF1α/HIF2α（C, D, E）。

GO富集分析結果顯示，這些基因高度富集在與癌症轉移相關的通路。對乳腺癌患者的scRNA-seq數據分析證實
，該轉移特征集主要在惡性細胞中高表達。

5、ZHX2相分離通過招募CTCF重塑染色質環

Co-IP和FRET-FLIM實驗證明，缺氧誘導了ZHX2和CTCF之間的直接相互作用（A, B），而PA突變體則無法與CTCF結合。免疫熒光顯示，CTCF本身在缺氧時也會形成核內斑點
，並與ZHX2凝聚體高度共定位（C），表明ZHX2的IDR依賴性相分離將CTCF“拉入”了凝聚體中。

Hi-C實驗進一步揭示
，缺氧導致了全局性的染色質環重編程，產生了大量缺氧特異性的染色質環（D）。這種染色質環的重塑依賴於ZHX2（E）。3C-qPCR實驗結果證實，ZHX2的PA突變體無法拯救由ZHX2敲低導致的MYC和STC2 E-P環的丟失（G）。

6、ZHX2相分離促進的S625/S628磷酸化是招募CTCF和驅動轉移的關鍵

蛋白質譜（LC-MS/MS）分析鑒定出ZHX2的兩個相分離增強的磷酸化位點：S625和S628。這兩個位點僅在缺氧時


，且在具有相分離能力的WT ZHX2上發生磷酸化，表明ZHX2相分離是其S625/S628位點磷酸化的先決條件。

將這兩個位點突變為丙氨酸（SA突變體）後，ZHX2與CTCF的相互作用被完全阻斷（D）。然而，SA突變體在缺氧時仍能正常發生相分離（形成斑點）

，但CTCF無法被招募到這些凝聚體中（E）。功能上
，SA突變體無法恢複缺失ZHX2後導致的染色質環形成和靶基因（125個相分離基因）的下調（F）。

在細胞遷移、侵襲實驗以及小鼠肺轉移模型中，PA突變體（喪失PS）和SA突變體（喪失CTCF招募）均喪失了促進轉移的能力（A-F）。

該研究提出了一個精細的調控模型：在缺氧條件下
，ZHX2首先通過其富含脯氨酸的IDR發生相分離，形成核內凝聚體。這種相分離狀態作為平台
，一方麵招募了MED1、BRD4和RNA Pol II等轉錄共激活因子；另一方麵

，它促進了ZHX2自身的S625和S628位點磷酸化。磷酸化的ZHX2進而獲得了與CTCF結合的能力，將CTCF招募到凝聚體中。最終，ZHX2-CTCF軸在凝聚體內重塑了染色質高級結構，形成了新的增強子-啟動子環（E-P looping），高效激活了包括MYC在內的一係列轉移相關癌基因，驅動癌症進展。該機製揭示了染色質環如何動態響應氧氣變化，並為靶向ZHX2-CTCF軸提供了新的癌症治療思路。