ONT Direct RNA全長轉錄組測序
項目簡介
ONT Direct RNA全長轉錄組測序
真核基因通常產生多種RNA異構體（isoform），可以產生功能上不同的蛋白質變體。傳統二代測序實際上是一種短讀長RNA-seq，難以獲得完整的轉錄本，無法體現異構體的多樣性。
表觀生物推出ONT Direct RNA全長轉錄組測序服務，基於Oxford Nanopore公司的納米孔測序平台，直接對RNA進行測序，具有長讀長的優勢，提高對異構體的檢測，還能直接檢測m6A、假尿嘧啶pseudoU等核酸修飾，在可變剪切研究方麵具有獨特的優勢。一次測序，即可滿足多項表觀遺傳轉錄組研究需求，大大提升研究的高度、深度、準確性、效率，尤其適用於多組學分子機製及珍貴的臨床樣本研究。
應用與優勢
技術應用
1. 對單個RNA分子進行單分子水平的全長測序
2. 識別更長的轉錄本，研究轉錄異構體
3. 繪製轉錄組上的m6A修飾圖譜，分辨率可達到單位點
4. 檢測RNA可變剪切的情況
技術優勢
1. 作為長讀長測序技術，能減少短讀長測序打斷後重新拚接帶來的歧義，結果準確度更高、更可信；
2. 能夠直接對RNA進行測序，避免逆轉錄和PCR擴增導致的RNA修飾信息缺失；
3. 可以直接檢測m6A等堿基修飾，配合優化的算法，獲得無損的m6A單堿基分辨率圖譜；
4. 一次測序，多套數據：轉錄組圖譜、m6A修飾圖譜、異構體、可變剪切情況，節省珍貴的臨床樣本，節省樣本準備時間和精力，且保持了樣本的統一性。
送樣要求
樣本物種： 僅限人、大小鼠，其他物種需評估
＞20ug
總RNA
1x10⁷
細胞數量
分析流程
分析內容
一、isoform分析
1. 可變剪切分析
2. 融合基因鑒定
3. SSR分析
4. LncRNA分析
5. PolyA分析
二、表達定量
1. 轉錄本定量
2. 轉錄本差異分析
3. 富集分析
4. 蛋白質互作網絡
三、甲基化修飾分析
1. m6A位點注釋
2. 甲基化修飾富集分析
3. m6A差異分析
四、isoform聯合定量表達分析
1. AltTP分析
2. 功能多樣性分析（FDA）
3. 差異富集分析
圖1. 不同basecalling模式下Q值的比較。單分子測序原始reads的中位準確率高達98.8%
圖2. 同時分析m6A和pseudoU，識別準確率分別為97.1%和97.6%
實測數據
圖4. 甲基化修飾-m6A修飾位點分布
圖3. isoform差異熱圖
圖5. m6A在RNA結構上的分布餅圖
圖6. isoform顯著差異火山圖
圖7. 全長轉錄本水平-差異分析
圖8. 全長轉錄本-DIU分析
圖9. 聯合分析-多維度和IPA結果
圖10. 全長轉錄本-整體變化
納米孔測序能從DRACH motif中檢測出m6A修飾
案例解讀
RNA直接測序應用於鑒定內源轉錄本異構體的m6A修飾
為了將RNA直接測序應用於單位點分辨率的RNA修飾從頭測序，研究員研發了利用納米孔RNA直接測序的m6A鑒定軟件（MINES），對HEK293T細胞轉錄本進行了分析，鑒定超過13,000個之前未注釋的DRACH位點的m6A甲基化狀態；還在人乳腺上皮細胞（包括異構體）中鑒定得40,000個位點，這些位點分別對m6A writer、METTL3、eraser、ALKBH5敏感。以上數據表明，納米孔RNA直接測序鑒定m6A修飾的效果優異。
原文：DANIEL A. LORENZ, et al. Direct RNA sequencing enablesm6A detection in endogenous transcript isoforms at base-specific resolution. RNA(2020) 26:19–28.
研究方案