mRNA m5C BS-seq技術服務,繪製單堿基分辨率m5C修飾圖譜
項目簡介
m5C是RNAjiajihuaxiushizhongfengdujiaodideyizhongleixing,danzaizhongliuzhongdeyanjiujinzhanyijingyinqileguangfanguanzhu。jinnianlai,suizhegaotongliangcexujishudefazhan,keyizaizhuanluzuzhonghenhaodeshibieduibaokuom5C在內的各種核苷酸甲基化修飾。m5C修飾可以影響RNA的穩定性、可變剪接、翻譯和轉錄後修飾等多個方麵,從而對基因表達和細胞功能產生影響。雖然有大量關於m5C在tRNA和rRNA中的數據,但由於mRNA的豐度較低,且缺乏有效的分離純化技術,對其在mRNA中的作用知之甚少。
為了推動mRNA m5C修飾研究,表觀生物最新推出單堿基分辨率的mRNA m5C BS-seq技術服務。該技術使用重亞硫酸鹽對不含修飾的C進行處理,使其在PCR之後轉換為T,而m5C修飾並不能進行該轉換。結合體外合成全轉錄組無修飾RNA技術,在mRNA m5C BS-seq中加入IVT RNA作為負對照,得到高置信度的m5C位點,降低了檢測結果中的假陽性率。
技術流程
分析內容
m5C BS-seq
1. 原始數據過濾、質控
2. 參考基因組比對
3. Peak calling
4. Peak注釋
5. GO富集分析
6. KEGG富集分析
7. Motifs分析
8. 信號矩陣分析(Peak熱圖)
9. CIMS 分析
10. 可視化文件
11. 差異分析(如果有多組樣品,進行差異分析,找出差異結合位點)
mRNA
1. 測序原始reads去接頭,質量控製
2. 參考基因組比對
3. 基因表達定量分析
4. 基因注釋
5. 差異表達分析
6. 差異基因熱圖繪製(僅限有生物學重複)
7. 差異基因GO分析
8. 差異基因KEGG分析
送樣要求
僅限人、大小鼠,其他物種需評估
樣本類型:
需要富集polyA mRNA
Total RNA:50ug/樣本
細胞:1.5*10⁷ 個細胞/樣本
組織:25 mg/樣本
2個月(A-B)和6個月大(C-D)時,Nsun5KO和WT小鼠卵巢m5C水平的Pearson相關性熱圖(A)和總體水平的小提琴圖(B)
研究案例
Clin Transl Med:Nsun5/m5C介導的母源mRNA調控—卵巢衰老和胚胎發育的關鍵[2]
這項研究揭示了RNA甲基轉移酶Nsun5及其介導的m5C修飾在調節卵巢功能和胚胎發育中的關鍵作用。研究人員利用Nsun5敲除(Nsun5KO)小鼠模型,並結合m5C-BS-seq、IF、WB和熒光素酶報告基因檢測等技術,研究了Nsun5缺失的影響。對不同年齡Nsun5KO和野生型小鼠卵巢的m5C-BS-seq分析顯示,與衰老相關的Nsun5KO小鼠m5C水平總體下降。值得注意的是,與卵母細胞成熟和生育能力相關的關鍵基因,如Mad2l2和Gdf9,在Nsun5KO小鼠中表現出m5C水平降低和蛋白質表達減少。進一步的研究證實了Nsun5與這些靶基因之間存在直接的相互作用。還發現Nsun5參與了對卵母細胞發育的調控。這些發現突出了Nsun5/m5C在控製母源mRNA穩定性方麵的新調控軸,為了解卵巢衰老和早期胚胎發育的機製提供了重要的見解。
重疊m5C基因的GO富集分析
韋恩圖顯示了2個月和6個月時,KO/WT比率小於0.8的m5C基因的重疊
參考文獻
[1]Zhang Z, Chen T, Chen HX, et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nat Methods. 2021;18(10):1213-1222.
[2]Ding C, Lu J, Li J, et al. RNA-methyltransferase Nsun5 controls the maternal-to-zygotic transition by regulating maternal mRNA stability. Clin Transl Med. 2022;12(12):e1137.