客戶文章 | CDD：NAT10通過ac4C修飾ETS2 mRNA驅動巨噬細胞炎症及心髒損傷新機製
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【DOI】10.1038/s41419-025-07796-6
【發表時間】2025年7月1日
【單位】複旦大學中山醫院心內科葛均波院士團隊
【關鍵詞】NAT10；ac4C RNA修飾；巨噬細胞激活；炎症性心髒功能障礙；內毒素血症；USP39；ETS2
【表觀生物提供】acRIP-seq、Ribo-seq
這項研究揭示了NAT10在LPS誘導的巨噬細胞激活和心髒功能障礙中的關鍵機製。研究團隊發現，在內毒素血症模型中，去泛素化酶USP39通過穩定NAT10蛋白，使其在巨噬細胞中顯著上調。高表達的NAT10通過ac4C修飾直接靶向轉錄因子Ets2的mRNA，增強其穩定性和翻譯效率，從而驅動巨噬細胞的促炎表型。更為重要的是，特異性敲除髓係NAT10或使用小分子抑製劑Remodelin，可顯著減輕炎症反應並改善小鼠的心髒功能，為治療膿毒症相關心肌損傷提供了新的潛在靶點。
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1.LPS通過促進USP39介導的去泛素化修飾穩定NAT10蛋白
研究團隊首先探究了炎症刺激對NAT10表達的影響。在骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）和RAW264.7細胞中，利用脂多糖（LPS）或IL-4處理後發現，LPS刺激顯著上調了NAT10的蛋白水平，且這種上調呈現出明顯的時間依賴性和劑量依賴性。值得注意的是，盡管蛋白水平顯著增加，但通過qPCR檢測發現Nat10的mRNA水平在激活後並未發生顯著變化，這提示NAT10的表達調控發生在轉錄後水平。
為了驗證這一點，研究人員使用了蛋白合成抑製劑放線菌酮（CHX）進行追蹤實驗，結果顯示在LPS刺激下，NAT10蛋白的半衰期顯著延長，表明LPS通過抑製蛋白降解來穩定NAT10。
進一步的機製研究發現，NAT10的降解主要通過蛋白酶體途徑進行，而非自噬或溶酶體途徑。在LPS刺激下，NAT10的泛素化水平顯著降低。
為了尋找調控這一過程的關鍵酶，研究團隊利用IP-MS技術篩選了NAT10的互作蛋白，並在交集中鑒定出唯一候選的去泛素化酶USP39。
免疫熒光和Co-IP實驗證實USP39與NAT10在細胞核內存在共定位和直接相互作用。功能驗證實驗表明，USP39通過特異性去除NAT10蛋白K498位點上的K48連接的多泛素鏈，從而阻斷其蛋白酶體降解途徑，維持其在炎症環境下的高水平表達。
2.NAT10缺失抑製巨噬細胞促炎激活並重塑ac4C修飾譜
為了明確NAT10在巨噬細胞炎症反應中的具體功能，研究人員構建了髓係特異性Nat10敲除小鼠（Nat10-/-），並分離BMDMs進行體外實驗。Western Blot和qPCR結果顯示，與對照組（Flox）相比，LPS刺激下的Nat10-/-巨噬細胞中，M1型巨噬細胞標誌物誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表達顯著降低。
同時關鍵促炎細胞因子（如IL-6, TNF-α, IFN-γ）的mRNA轉錄水平和培養基中的分泌水平均大幅下降。
流式細胞術分析進一步證實，NAT10缺失導致巨噬細胞表麵共刺激分子CD80和CD86的表達顯著減少，表明巨噬細胞的促炎激活受到抑製。此外，使用NAT10的小分子抑製劑Remodelin處理也能在野生型細胞中產生類似的抗炎效果，驗證了NAT10作為治療靶點的潛力。
研究團隊進一步通過acRIP-seq測序分析。結果顯示，NAT10介導的ac4C修飾主要富集在mRNA的CDS區和3'UTR區，且識別基序符合經典的CXXCXX序列。
差異分析表明，NAT10敲除後，大量與炎症激活和RNA加工相關的轉錄本呈現低乙酰化狀態。累積分布函數（CDF）分析揭示，NAT10並非通過改變整體mRNA的豐度，而是通過特異性調節關鍵基因的ac4C修飾水平來影響巨噬細胞的炎症表型，這為後續尋找特異性靶點提供了重要線索
3.NAT10通過ac4C修飾增強Ets2 mRNA的穩定性及翻譯效率
為了精準鎖定NAT10調控的下遊靶基因，研究人員聯合分析了acRIP-seq、Ribo-seq和RNA-seq（由表觀生物提供）的多組學數據。在三組數據的交集中，轉錄因子Ets2被鑒定為受NAT10直接調控的核心靶點。
IGV可視化分析清晰地展示了NAT10敲除後Ets2 mRNA上的ac4C峰值顯著降低，這一結果得到了ac4C-RIP-qPCR的驗證。進一步的NAT10-RIP-qPCR和RNA pull-down實驗證實，NAT10蛋白能夠直接結合Ets2的mRNA轉錄本。
在機製層麵，RNA穩定性實驗表明，NAT10缺失導致Ets2 mRNA的半衰期顯著縮短，說明ac4C修飾增加了其穩定性。
更關鍵的是，Polysome profiling（多核糖體分析）和雙素熒光素酶報告基因實驗顯示，NAT10缺失導致Ets2 mRNA在多核糖體組分（翻譯活躍區）中的分布顯著減少，證明ac4C修飾對維持Ets2的高效翻譯至關重要。
功能回複實驗進一步確立了這一軸線的因果關係：在Nat10-/-巨噬細胞中通過慢病毒過表達Ets2，可以顯著回補iNOS及促炎因子的表達水平，部分逆轉NAT10缺失導致的抗炎表型。這些結果詳盡地闡明了“NAT10-ac4C-Ets2”軸在驅動巨噬細胞炎症反應中的核心分子機製。
4.靶向NAT10顯著改善內毒素血症誘導的心髒功能障礙
研究最後在LPS誘導的ETM小鼠模型中驗證了NAT10的病理生理意義。實驗結果顯示，LPS攻擊後，小鼠心髒組織中浸潤的巨噬細胞內NAT10和Ets2的蛋白表達水平均顯著上調。
生存分析表明，髓係特異性Nat10敲除小鼠在LPS致死劑量攻擊下的存活率顯著高於對照組。
利用超聲心動圖對心功能進行評估，發現Nat10敲除顯著改善了內毒素血症引起的心力衰竭症狀，表現為左室射血分數（LVEF）、短軸縮短率（LVFS）和每搏輸出量（LVSV）的顯著回升，心率波動也更為平穩。
H&E染色結果顯示，Nat10敲除組小鼠心肌組織中的細胞空泡化、白細胞浸潤和間質水腫等病理改變明顯減輕。
血清生化指標分析進一步證實，心肌損傷標誌物肌鈣蛋白T（cTnT）、肌鈣蛋白I（cTnI）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的釋放顯著減少。此外，免疫組化和流式細胞術分析顯示，心肌組織中CD68+iNOS+促炎巨噬細胞的浸潤大幅減少，血清及心髒組織中的促炎因子（IL-6, TNF-α等）水平也顯著降低。
同樣地，預防性給予NAT10抑製劑Remodelin也能模擬基因敲除的保護作用，顯著提高膿毒症小鼠的生存率並改善心髒功能。這些體內實驗數據有力地證明了靶向NAT10是治療膿毒症相關心肌功能障礙的有效策略。
該研究闡明了NAT10在巨噬細胞炎症激活和膿毒症心肌病中的轉錄後調控機製：在炎症刺激（LPS）下，去泛素化酶USP39與NAT10相互作用並去除其K48泛素鏈，導致NAT10蛋白積累；穩定的NAT10通過催化Ets2 mRNA的ac4C修飾，增強了Ets2的mRNA穩定性和翻譯效率；上調的Ets2轉錄因子進一步驅動巨噬細胞的促炎程序，最終導致全身炎症和心肌損傷。這一發現不僅擴展了ac4C修飾在免疫調節中的功能認知，也為膿毒症心肌病的治療提供了基於表觀轉錄組學的潛在策略。
複旦大學附屬中山醫院肖子龍為共同第一作者。複旦大學附屬中山醫院宿燕崗教授、梁義秀教授為通訊作者。該研究由國家自然科學基金（No.82170386、No.82100370）資助。
