長鏈非編碼RNA編碼短肽鑒定與功能機製研究
1.立項依據
lncRNAs分子,它是一組長度超過200個核苷酸的RNA轉錄物，lncRNAs可分為5類：正義 lncRNA、反義 lncRNA、基因間lncRNA、基因內lncRNA和雙向 lncRNA[4]。可通過調節染色質重構，DNA修飾，組蛋白及蛋白質修飾等多種方式發揮功能[1]。由於lncRNAs缺乏長的或保守的開放閱讀框（ORF），多年來被認為不可編碼蛋白質但可廣泛參與機體的生理和病理活動[5,3]。有研究報道，TGFB2-OT1 作為lncRNA來吸附miRNA進而誘導下遊基因表達變化影響炎症反應[2]。另外還有大量研究發現lncRNA可參與機體炎症反應，如炎症性腸炎[6]、變應性鼻炎[7]和病原菌誘導的急慢性炎症反應等[8]。除在炎症放麵的研究報道外，lncRNAs還參與了癌症等疾病的發生發展過程，如HOTAIR可促進癌細胞增殖和間質樣轉化[9]；H19在乳腺癌細胞增殖中起著重要的作用[10]以及LSINCT5[11]、LincRNA-ROR[12]和MEG3[13]等lncRNA參與了多種癌症的發展過程。
在已有報道中lncRNA最多作用方式為lncRNA結合microRNA，從而防止microRNA靶基因的降解；lncRNA結合蛋白直接抑製蛋白發揮作用；lncRNA結合DNA調控基因表達；作為分子伴侶，結合蛋白質並將其定位到DNA序列上進而調控表達。然而隨著技術的發展，特別是核糖體分析和質譜（MS）蛋白質組學的發展，人們發現了許多具有編碼潛力的IncRNAs[14,15,16]。lncRNAs編碼的多肽功能也逐漸被研究報道，如SPAR，一種LINC00961編碼肽，它在人類和小鼠中長度不相同但可調節mTORC1的活性並抑製肌肉再生[17]；lncRNA HOXB-AS3，能夠抑製結腸癌細胞的生長、克隆形成和侵襲轉移[18]。作為一類新的細胞調節因子在關鍵的致癌通路中仍待進一步揭示，因此從lncRNAs編碼多肽的角度探究疾病發生可為臨床診斷和治療提供依據。
1.2研究意義
在人類和小鼠中發揮重要生物學功能的LncRNA編碼的微蛋白通常在物種間保守[19,20,17]，但此方麵的研究報道較少。本研究方案從癌症細胞中測序得到差異表達的lncRNAs並從中分析出具有編碼潛能的RNA，經實驗驗證可從中發現對疾病發生發展具有明顯作用的lncRNAs來源的短肽並對其作用機製進行深入的探討。已被報道的lncRNAs在疾病中所發揮的作用可能源於其所編碼的短肽。這將從新的角度對疾病及癌症的研究提供理論依據。
2.研究目標
本研究目標旨在發現新的具備編碼能力的lncRNA,並解析其在疾病中的生物學功能，為將來的醫療提供新型的標誌物或潛在的藥物靶標。
3.研究內容
內容一、處理組和對照組細胞整體翻譯水平變化研究；
內容二、鑒定顯著差異翻譯效率的基因；
內容三、鑒定腫瘤特異性短肽；
內容四、腫瘤密碼子使用圖譜；
內容五、鑒定腫瘤特異的新生抗原；
內容六、實驗驗證及功能機製探究。
4.創新點和擬解決的關鍵科學問題
4.1創新點
本研究方案以Ribo-seq和longRNA-seq技術手段聯合分析從lncRNA翻譯短肽的角度探究癌症的發生發展過程。目前關於非編碼RNAdeyanjiuzhuyaojizhongzaiqizuoweihesuanlianfahuizuoyongdejieduan，duiqibianmaduantaideqiannengguanzhujiaoshao。benxiangmunitongguofaxianxinshengtai，shituweitanjiuaizhengdefashengfazhanjizhitigongxindelilunyiju,並為臨床檢測和治療提供參考。
4.2擬解決的關鍵科學問題
問題一、病人病灶組織中是否有表達異常的lncRNA？
問題二、異常表達的lncRNA中是否有可編碼短肽的RNA？
問題三、lncRNA編碼的新生短肽是怎樣影響疾病發生發展？
問題四、這些可調控疾病進程的新生短肽是否能作為臨床診斷和治療的參考？
5.研究方法及技術路徑
5.1研究方法
5.1.1實驗樣本
• 送樣要求
（1）樣本類型：活細胞樣本，細胞數量≥ 1×107
（2）樣本物種：僅限人、大小鼠，其他物種需評估
• 樣品分組
（1）常規要求至少 2 組樣品，包括對照組和實驗組（臨床樣本為正常人組和患者組）
（2）每個樣品均進行 Ribo-seq 和 lncRNA-seq（采用去 rRNA 建庫法）
（3）樣本數建議：3 VS 3
5.1.2建庫及高通量測序
圖1. Ribo-seq建庫流程圖
永順
圖2.Ribo-seq和longRNA-seq測序分析流程圖
5.2技術路徑
6關鍵技術
6.1 技術原理
Ribo-seq測序原理：
利用低濃度 RNase 處理核糖體-新生肽鏈複合物，降解沒有核糖體覆蓋的 mRNA 片段，隨後再去除核糖體，通過二代測序技術檢測被核糖體保護的約 22-30 bp 的 RNA 小片段（稱為 ribosome footprints，RFPs；又稱 ribosome protected fragments，RPFs），可得到核糖體分布的位置信息，據此可得到每種轉錄本上核糖體的分布、密度，可推測起始密碼子位置（包括非 ATG 起始）、ORF（開放閱讀框）位置、翻譯暫停區域以及 uORFs （上遊開放閱讀框）等信息。
LongRNA-seq測序原理：
LongRNA-seq是一種全麵檢測細胞和組織長片段RNA（>200nt）的轉錄組測序方法,包括線性的mRNA和lncRNA分子以及circRNA，可準確高效揭示轉錄組的表達全貌，是非編碼RNA的重要研究技術。它是將樣品進行提取RNA後建庫測序，然後對原始數據進行質控並去除rRNA。將質控後的數據比對到參考基因組，得到比對成功和比對不成功的兩組序列。將比對成功的序列進行注釋並定量分析得到mRNA和lncRNA，將比對不成功的序列反向拚接之後比對參考基因組，比對上參考基因組的及為circRNA.
6.2 分析內容
圖3.測序及生物信息分析內容
參考文獻
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