環狀RNA翻譯蛋白質鑒定與功能機製研究
1.立項依據
1.1研究背景
隨著生命科學的發展，目前科學家們已經從DNA、mRNA、miRNA和蛋白質等分子水平對許多疾病有了深入的研究，但病理機製仍不完全明白，尤其是癌症疾病仍為醫學難題。而環狀RNA（circRNAs）在疾病中的作用逐漸被科學家們發現並且它們在疾病發展中都有調控作用[1]，關於circRNAs編碼多肽的功能也逐漸被研究報道[2,3]。
circRNAs 是一類不具帽子和尾巴並以共價鍵形成環形結構的RNA 分子，它不受RNA外切酶影響，表達穩定不易降解。目前已知的環狀 RNA 可分為外顯子環狀 RNA，內含子環狀RNA和外顯子-內含子環狀RNA，後者環狀RNA是一種既包含了外顯子又含有一段內含子序列的環狀RNA。它可以多種方式發揮功能：可作為“海綿”吸附microRNA，防止microRNA與mRNA相互作用，間接調控microRNA下遊靶基因的表達；通過與mRNA結合蛋白結合，進而改變mRNA剪接模式；可與RNA聚合酶Ⅱ結合影響轉錄進程。研究發現大量circRNAs參與疾病調節，如環狀RNA hsa_circ_0005105，它可參與調節骨關節炎的病理過程[4]、circ_Amotl1可參與乳腺癌的發病過程[5]、 RNAhas_circ_0067934可促進食管鱗狀細胞癌細胞增殖[6]和circPVT1促進胃癌細胞增殖等[7]。
然而隨著技術的發展，特別是核糖體分析和質譜（MS）蛋白質組學的發展，人們發現了許多具有編碼潛力的circRNAs[8,9]，如circ-FBXW7、circ-SHPRH和circPINTexon2，他們可編碼成多肽並且具有抑製膠質瘤細胞的功能[10,11,12]。然而關於circRNA編碼多肽在癌症等疾病中的探究相對較少，因此circRNA編碼多肽的探究有望為癌症等疾病發生發展機製的探究從新角度提供有力參考。
1.2研究意義
本研究方案從癌症細胞中測序得到差異表達的circRNAs並從中分析出具有編碼潛能的RNA，經實驗驗證可從中發現對疾病發生發展具有明顯作用的circRNAs來源的多肽並對其作用機製進行深入的探討。已被報道的circRNAs在疾病中所發揮的作用可能源於其所編碼的多肽，這將從新的角度對疾病及癌症的研究提供理論依據。
2.研究目標
本研究目標旨在發現新的具備編碼能力的circRNA,並解析其在疾病中的生物學功能，為將來的醫療提供新型的標誌物或潛在的藥物靶標。
3.研究內容
內容一、處理組和對照組細胞整體翻譯水平變化研究；
內容二、鑒定顯著差異翻譯效率的基因；
內容三、鑒定腫瘤特異性多肽；
內容四、腫瘤密碼子使用圖譜；
內容五、鑒定腫瘤特異的新生抗原；
內容六、實驗驗證及功能機製探究。
4.創新點和擬解決的關鍵科學問題
4.1創新點
癌症致死率高，發病機製難以探究一直是困擾科學家的難題。本研究方案以Ribo-seq和longRNA-seq技術手段聯合分析從circRNA翻譯多肽的角度探究癌症的發生發展過程。本項目擬通過發現新生肽，試圖為探究癌症的發生發展機製提供新的理論依據,並為臨床檢測和治療提供參考。
4.2擬解決的關鍵科學問題
問題一、病人病灶組織中是否有表達異常的circRNA？
問題二、異常表達的circRNA中是否有可編碼多肽的RNA？
問題三、circRNA編碼的新生多肽是怎樣影響疾病發生發展？
問題四、這些可調控疾病進程的新生多肽是否能作為臨床診斷和治療的參考？
5.研究方法及技術路徑
5.1研究方法
• 送樣要求
（1）樣本類型：活細胞樣本，細胞數量≥ 1×107
（2）樣本物種：僅限人、大小鼠，其他物種需評估
• 樣品分組
（1）常規要求至少 2 組樣品，包括對照組和實驗組（臨床樣本為正常人組和患者組）
（2）每個樣品均進行 Ribo-seq 和 lncRNA-seq（采用去 rRNA 建庫法）
（3）樣本數建議：3 VS 3
圖1. Ribo-seq建庫流程圖
永順
圖2.Ribo-seq和longRNA-seq測序分析流程圖
5.2技術路徑
6關鍵技術
6.1 技術原理
Ribo-seq測序原理：
利用低濃度 RNase 處理核糖體-新生肽鏈複合物，降解沒有核糖體覆蓋的 mRNA 片段，隨後再去除核糖體，通過二代測序技術檢測被核糖體保護的約 22-30 bp 的 RNA 小片段（稱為 ribosome footprints，RFPs；又稱 ribosome protected fragments，RPFs），可得到核糖體分布的位置信息，據此可得到每種轉錄本上核糖體的分布、密度，可推測起始密碼子位置（包括非 ATG 起始）、ORF（開放閱讀框）位置、翻譯暫停區域以及 uORFs （上遊開放閱讀框）等信息。
LongRNA-seq測序原理：
LongRNA-seq是一種全麵檢測細胞和組織長片段RNA（>200nt）的轉錄組測序方法,包括線性的mRNA和lncRNA分子以及circRNA，可準確高效揭示轉錄組的表達全貌，是非編碼RNA的重要研究技術。它是將樣品進行提取RNA後建庫測序，然後對原始數據進行質控並去除rRNA。將質控後的數據比對到參考基因組，得到比對成功和比對不成功的兩組序列。將比對成功的序列進行注釋並定量分析得到mRNA和lncRNA，將比對不成功的序列反向拚接之後比對參考基因組，比對上參考基因組的及為circRNA。
6.2 分析內容
圖3.測序及生物信息分析內容
參考文獻
[1] Zhang He-da,Jiang Lin-Hong,Sun Da-Wei,Hou Jun-Chen,Ji Zhen-Ling. CircRNA: a novel type of biomarker for cancer.[J]. Breast cancer (Tokyo, Japan),2018,25(1).
[2] Chen He,Liu Ying,Li Peiling,Zhu Daling. RE: Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.[J]. Journal of the National Cancer Institute,2018.
[3] Zhang Maolei,Huang Nunu,Yang Xuesong,Luo Jingyan,Yan Sheng,Xiao Feizhe,Chen Wenping,Gao Xinya,Zhao Kun,Zhou Huangkai,Li Ziqiang,Ming Liu,Xie Bo,Zhang Nu. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis.[J]. Oncogene,2018,37(13).
[4] Wu You,Zhang Ying,Zhang Yu,Wang Jia-Jia. CircRNA hsa_circ_0005105 upregulates NAMPT expression and promotes chondrocyte extracellular matrix degradation by sponging miR-26a.[J]. Cell biology international,2017,41(12).
[5] Yang Qi,Du William W,Wu Nan,Yang Weining,Awan Faryal Mehwish,Fang Ling,Ma Jian,Li Xiangmin,Zeng Yan,Yang Zhenguo,Dong Jun,Khorshidi Azam,Yang Burton B. A circular RNA promotes tumorigenesis by inducing c-myc nuclear translocation.[J]. Cell death and differentiation,2017,24(9).
[6] Xia Wenjia,Qiu Mantang,Chen Rui,Wang Siwei,Leng Xuechun,Wang Jie,Xu Youtao,Hu Jingwen,Dong Gaochao,Xu Prof Lin,Yin Rong. Circular RNA has_circ_0067934 is upregulated in esophageal squamous cell carcinoma and promoted proliferation.[J]. Scientific reports,2016,6.
[7] Jie Chen,Yan Li,Qiupeng Zheng,Chunyang Bao,Jian He,Bin Chen,Dongbin Lyu,Biqiang Zheng,Yu Xu,Ziwen Long,Ye Zhou,Huiyan Zhu,Yanong Wang,Xianghuo He,Yingqiang Shi,Shenglin Huang. Circular RNA profile identifies circPVT1 as a proliferative factor and prognostic marker in gastric cancer[J]. Cancer Letters,2017,388.
[8] Ruiz-Orera,J.,Messeguer,X.,Subirana,J.A.,and Alba,M.M.Long non-coding RNAs as a source of new peptides[J].eLife,2014,e03523.
[9] Xu Li,Wenqi Wang,Junjie Chen.Recent progress in mass spectrometry proteomics for biomedical research[J].Science China(Life Sciences),2017,60(10):1093-1113.
[10]Chen He,Liu Ying,Li Peiling,Zhu Daling. RE: Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.[J]. Journal of the National Cancer Institute,2018.
[11]Zhang Maolei,Huang Nunu,Yang Xuesong,Luo Jingyan,Yan Sheng,Xiao Feizhe,Chen Wenping,Gao Xinya,Zhao Kun,Zhou Huangkai,Li Ziqiang,Ming Liu,Xie Bo,Zhang Nu. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis.[J]. Oncogene,2018,37(13).
[12]Zhang Maolei,Zhao Kun,Xu Xiaoping,Yang Yibing,Yan Sheng,Wei Ping,Liu Hui,Xu Jianbo,Xiao Feizhe,Zhou Huangkai,Yang Xuesong,Huang Nunu,Liu Jinglei,He Kejun,Xie Keping,Zhang Gong,Huang Suyun,Zhang Nu. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma.[J]. Nature communications,2018,9(1).
