AML（急性髓係白血病）是一種高度異質性的惡性克隆性疾病，其中t(8;21)染色體易位是最常見的細胞遺傳學異常，約占AML患者的10%-15%。盡管t(8;21) AML患者對標準化療的初始緩解率較高，但複發和耐藥仍是主要臨床挑戰，長期生存率仍不理想。複發的根源在於LSC（白血病幹細胞）的存在
，這些細胞具有靜止、自續能力和對化療的固有耐受性。

表觀遺傳修飾介導的染色質可及性重塑是LSC維持幹性特征的關鍵機製。多項研究表明，SWI/SNF染色質重塑複合物、KDM家族去甲基化酶以及多種KMT（組蛋白賴氨酸甲基轉移酶）通過調控增強子/啟動子區域的染色質開放狀態，驅動LSC核心基因表達程序。SETD8（KMT5A）是唯一已知的催化H4K20me1的甲基轉移酶
，在多種實體瘤幹細胞中已被證實對維持幹性和染色質開放至關重要。然而，SETD8在AML尤其是t(8;21)亞型LSC中的功能尚未明確。

此外，近年來研究發現AML LSC相較於正常造血幹細胞更依賴線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）而非糖酵解來滿足能量需求
，線粒體穩態失調可選擇性損傷LSC功能。但組蛋白甲基化修飾與線粒體功能之間的直接調控聯係仍少有報道。SETD8是否通過表觀遺傳機製調控線粒體穩態，從而維持t(8;21)AML LSC的幹性
？

 

2025年11月，深圳大學總醫院於力教授/周景峰教授團隊在《Cancer Research》發表題為“Loss of SETD8 Impairs Mitochondrial Homeostasis to Suppress Leukemia Stem Cell Function in t(8;21) Acute Myeloid Leukemia”的研究論文。該研究發現組蛋白賴氨酸甲基轉移酶SETD8在t(8;21) AML LSC幹性維持中不可或缺。遺傳敲除或藥物抑製SETD8均顯著損傷小鼠模型及原代患者來源LSC的存活與自續能力。機製上，SETD8通過在RHOT1基因增強子區域增加染色質可及性
，促進RHOT1表達，從而重編程線粒體穩態。該研究揭示了組蛋白賴氨酸甲基化與線粒體功能的新聯係
，並提示SETD8為t(8;21) AML潛在可藥靶點。

 

研究路線

 

實驗設計

 

關鍵研究結果

1.SETD8 在 t(8;21) AML 中呈特異性高表達且提示預後不良

研究團隊通過分析公共數據庫（GSE6891）及臨床樣本，係統驗證了SETD8 在 t(8;21) AML 中的特異性表達模式。結果顯示
，SETD8 不僅在白血病細胞群體中普遍高表達，更在富含白血病幹細胞的 CD34+ 亞群中顯著上調。生存分析表明
，SETD8 高表達與 t(8;21) AML 患者的OS（總生存期）和EFS（無事件生存期）縮短顯著相關
，而這種相關性在非 t(8;21) AML 亞型中未被觀察到。此外，在 AE9a 誘導的小鼠模型中，LSC 內SETD8的 mRNA 和蛋白水平亦顯著富集，提示其在該亞型 LSC 的維持中具有關鍵作用。

圖1. B）Kaplan-Meier 生存曲線顯示，在 t(8;21) AML 患者隊列中，SETD8 高表達組的 OS 和 EFS 均顯著低於低表達組（P < 0.05），但在非 t(8;21) 亞型或整體AML 隊列中未見此相關性
；C）統計圖顯示，t(8;21) AML 患者原代 CD34+ 細胞中的 SETD8 mRNA 水平顯著高於健康供者及非 t(8;21) AML 患者
，差異具有統計學意義

 

2.SETD8是維持AML1-ETO9a驅動的小鼠t(8;21)AML進展的關鍵因子

利用 SETD8 條件性敲除小鼠與AE9a 逆轉錄病毒誘導模型，研究證實 SETD8 的遺傳學缺失能顯著抑製白血病進程。敲除組小鼠生存期顯著延長，伴隨外周血白細胞計數下降及脾腫大減輕；流式分析顯示骨髓和脾髒中的白血病細胞負荷及LSC 比例大幅降低。LDA（極限稀釋移植）實驗進一步證實
，SETD8 缺失導致 LSC 的功能頻率急劇下降（約16倍），且二級移植和競爭性移植實驗表明 LSC 的長期自我更新能力受到不可逆的損傷。而且，該表型在 MLL-AF9 驅動的模型中未出現，證實了其亞型特異性。

圖2. E）Kaplan-Meier生存曲線顯示，Setd8敲除組小鼠中位生存期從對照組的約130天顯著延長至181天（P<0.001）

，表明Setd8缺失有效延緩白血病進展；G-H）流式細胞術代表圖及定量統計顯示，骨髓和脾髒中AE9a+白血病細胞
、Lin- AE9a+ c-Kit+祖細胞以及AE9a+ Mac-1-未成熟細胞比例在敲除組均顯著降低（P<0.01）；K）極限稀釋移植（LDA）分析表格和曲線顯示，Setd8缺失將LSC功能頻率從對照組的1/1,845大幅降低至1/30,678，伴隨95%置信區間分離，證實LSC自續能力嚴重受損。

 

 

3.SETD8 缺失選擇性抑製 t(8;21) AML 細胞的增殖與克隆形成

在t(8;21)AML細胞係（Kasumi-1
、SKNO-1）中，利用CRISPR/Cas9敲除SETD8導致下遊組蛋白標記H4K20me1幾乎完全丟失，細胞增殖速率顯著減緩，克隆形成能力基本喪失。相比之下，非t(8;21)AML細胞係對SETD8缺失不敏感，表明SETD8對t(8;21)亞型具有高度選擇性的依賴性。

圖3. A）Western blot顯示，在sgSETD8轉導的Kasumi-1和SKNO-1細胞中
，SETD8蛋白及下遊H4K20me1標記幾乎完全消失，而對照sgCtrl組保持高水平表達；B）細胞計數生長曲線顯示，SETD8敲除後Kasumi-1和SKNO-1細胞增殖速率從第4天起顯著低於對照組，最終活細胞數減少約70%-80%（P<0.001）；C）甲基纖維素克隆形成實驗照片及統計顯示，SETD8敲除組克隆數目和大小均顯著減少，克隆形成率下降至對照組的20%以下。

 

4.SETD8 對患者原代 CD34+ 細胞的存活與自我更新至關重要

在t(8;21)AML患者原代CD34+細胞中

，shRNA介導的SETD8敲低顯著誘導了細胞凋亡，且該效應在富含LSC的CD34+CD38-亞群及處於靜止期（G0期）的細胞中尤為顯著。功能實驗顯示，SETD8敲低不僅抑製了細胞增殖
，更完全阻斷了連續再鋪板能力。PDX模型進一步證實，SETD8 敲低極顯著降低了人源白血病細胞在受體小鼠體內的植入負荷
，而對正常臍帶血CD34+細胞的克隆形成無明顯毒性
，提示了良好的治療窗口。

圖4. D-E）Annexin V/7-AAD流式代表圖及統計顯示
，SETD8敲低後CD34+CD38- LSC亞群及靜止期（Pyronin Y低）CD34+細胞凋亡率顯著升高，較對照增加2-4倍；G）連續三代甲基纖維素再鋪板實驗顯示，SETD8敲低組從第二代起克隆數持續銳減，至第三代幾乎無克隆形成
，反映自續能力完全喪失；I）PDX模型流式統計顯示，SETD8敲低組受者小鼠骨髓和脾髒中人源hCD45+ hCD34+ hCD38- LSC比例顯著低於對照組（P<0.01）。

 

 

5.小分子抑製劑UNC0379可靶向清除t(8;21)AML LSC並延長生存期

SETD8選擇性小分子抑製劑UNC0379在體外呈劑量依賴性地誘導原代 t(8;21)AML CD34+細胞凋亡，並有效抑製其連續克隆形成能力。在 AE9a小鼠模型中
，UNC0379 單藥治療顯著延長了荷瘤小鼠生存期
，緩解了脾腫大症狀。極限稀釋移植分析證實，藥物處理大幅降低了功能性LSC的頻率。此外
，治療組小鼠體重及正常造血指標未見明顯異常，體現了該抑製劑良好的體內安全性。

圖5. A-B）流式圖及統計顯示，UNC0379處理後患者CD34+CD38-及靜止期細胞凋亡比例顯著升高

，呈濃度依賴性（1-5 μM）；D）連續再鋪板實驗顯示
，UNC0379處理組克隆形成能力從第一代起持續受抑
，至第三代克隆數減少90%以上
；F）Kaplan-Meier曲線顯示，UNC0379治療組小鼠中位生存期顯著延長（P<0.001）
，伴隨脾腫大減輕
；K）極限稀釋移植分析顯示，UNC0379治療將LSC頻率從對照的1/2,876降低至1/30,390
，差異顯著。

 

6.SETD8缺失對小鼠正常造血穩態影響微弱

SETD8條件敲除對穩態小鼠外周血常規參數
、骨髓譜係分布及多種造血幹/祖細胞（HSPC）比例影響輕微，僅少數祖細胞總數略有下降。體外克隆形成能力和體內長期競爭移植重建實驗顯示
，敲除組髓係、淋係和紅係重建造血基本正常，證實SETD8抑製對正常造血的毒性有限
，具有較好的治療窗口。

圖6. A：外周血常規檢測顯示，SETD8敲除小鼠白細胞
、紅細胞
、血小板計數及血紅蛋白水平與野生型對照無顯著差異。C：流式分析顯示

，骨髓中LT-HSC、ST-HSC、MPP等多能祖細胞比例在敲除組保持正常，僅部分committed祖細胞輕度減少。F-G：長期競爭移植（16周後）流式統計顯示，SETD8敲除供者來源的髓係（Mac-1+）、B係（B220+）和T係（CD3+）細胞比例與對照相當，重建能力保留。

 

7.SETD8 通過重塑增強子染色質開放性調控線粒體關鍵基因RHOT1

通過RNA-seq、ATAC-seq和CUT&Tag（H4K20me1、H3K27ac）多組學整合（ATAC-seq、CUT&Tag由表觀生物提供），研究篩選出SETD8直接調控的168個基因，其中線粒體外膜相關通路顯著富集
，鎖定RHOT1為關鍵下遊靶點。SETD8缺失導致RHOT1上遊-15 kb增強子區域H4K20me1、H3K27ac及染色質開放度同步下降；使用CRISPRa/CRISPRi及dCas9-SETD8融合蛋白功能驗證證實，該增強子對RHOT1轉錄激活至關重要。

圖7. D）GO富集氣泡圖顯示，SETD8調控的下遊基因顯著富集於線粒體外膜（mitochondrial outer membrane）通路
，調整P值極顯著
；J）ATAC-seq和CUT&Tag軌跡圖顯示，SETD8敲除後RHOT1上遊增強子#5931區域的染色質可及性、H4K20me1和H3K27ac峰值信號均顯著減弱；M-N）Western blot和qRT-PCR顯示
，dCas9-SETD8融合蛋白靶向該增強子可顯著恢複或上調RHOT1蛋白及mRNA表達水平
，CRISPRi則相反。

 

8.RHOT1缺失誘發線粒體穩態失衡並阻滯t(8;21)AML進展

RHOT1 shRNA敲低在AE9a小鼠模型中顯著延長生存
、減少白血病負荷，體外誘導細胞凋亡並抑製克隆形成。機製上
，RHOT1缺失導致線粒體異常積累、活性氧（ROS）超氧化物產生增多、膜電位去極化以及ATP水平下降，提示線粒體穩態嚴重失調。

 

圖8. D）Kaplan-Meier曲線顯示，RHOT1敲低組小鼠生存期顯著延長，外周血和器官白血病浸潤減少；J）MitoTracker與Hoechst共染共聚焦圖像及定量顯示，RHOT1敲低後線粒體/核熒光強度比顯著升高，表明線粒體異常積累；K-M）MitoSOX和TMRE流式顯示，RHOT1敲低導致線粒體超氧化物產生比例及膜電位去極化細胞比例顯著增加
；N）ATP發光測定顯示，RHOT1敲低細胞內ATP水平較對照下降約50%，反映氧化磷酸化受損。

 

9.強製表達RHOT1可逆轉SETD8缺失誘導的線粒體功能障礙與表型

在SETD8敲除或抑製背景下，強製過表達RHOT1可完全或部分救援細胞增殖抑製、克隆形成能力喪失以及線粒體功能異常

，包括降低超氧化物水平、恢複膜電位和ATP產生
，並在Seahorse實驗中恢複氧耗率（OCR）。該救援效應在細胞係和原代患者細胞中均得到驗證
，確立了SETD8-RHOT1軸的線性功能關係。

圖9. C-D）克隆形成照片
、統計及生長曲線顯示，RHOT1過表達完全逆轉SETD8敲除導致的克隆數減少和增殖抑製
，恢複至接近對照水平；F-H）流式和ATP測定顯示，RHOT1過表達顯著降低超氧化物產生、恢複膜電位並提升ATP水平，逆轉SETD8缺失誘導的線粒體應激
；I）Seahorse實時氧耗率曲線及統計顯示，RHOT1過表達使基礎OCR
、最大OCR及備用呼吸容量均恢複正常，證實線粒體氧化磷酸化功能得到拯救。

 

小結：

文章討論強調SETD8作為t(8;21) AML LSC關鍵表觀調控因子的上下文特異性：其催化的H4K20me1在該亞型中主要發揮促進染色質開放和轉錄激活作用，尤其通過遠端增強子調控RHOT1表達，建立組蛋白單甲基化與線粒體穩態的新聯係。RHOT1缺失導致線粒體應激而非單純能量不足

，解釋了SETD8抑製對LSC的選擇性殺傷，同時對正常造血影響輕微。UNC0379的體內療效及LSC頻率下降為臨床轉化提供了強有力證據

，提示SETD8抑製劑可作為克服t(8;21) AML複發的新策略。需進一步探索SETD8非組蛋白底物及其他間接調控通路，以全麵闡明其在白血病中的多麵作用。